潔凈手術室在使用過程中，應保持一個封閉環境，其門、傳遞窗等均應關閉。現在有些潔凈手術室在使用時開著門，這顯然是不允許的。究其原因是因為新風量不足，醫護人員感到氣悶。對此情況，應當從系統上查找原因，通過運行調節改善新風供應。
在潔凈手術室工作的人員，其活動不要過于激烈，防止衣著鞋帽等纖維質材料過多的脫落，造成室內潔凈度的超標。一般來說無論是醫生還是護士都應當有較為固定的活動范圍及活動路線。做清潔的操作可在送風側進行；做不清潔的、有污染的操作，可在回風口附近進行。
所有進入潔凈手術室的物品均需清潔、消毒，個人物品及未按規定清潔、消毒的物品不準帶入潔凈手術室內。潔凈室使用器具的選用及擺放位置也應當考慮潔凈因素，所有器具的擺放都不應將回風口擋住。手術用的器具、敷料等應預先消毒，進入潔凈手術室后放入器械柜內，手術前才能打開，盡量減少與空氣接觸。
人流通道及物流通道應各盡其用，應利用傳遞窗進行物品的傳遞。特別是污物，要通過污物傳遞窗直接進入污物走廊，以免污染潔凈區。
應組建潔凈手術室的醫院感染控制小組，由手術部主任、麻醉醫師、護士長和護士等相關人員組成，全面負責手術室感染監控工作。應安排一名潔凈手術部專職管理護士，對進潔凈手術部的人員要進行經常性監督，檢查手術室消毒隔離措施及手術人員的無菌技術操作，對違反操作規程或可疑污染環節應及時糾正，并采取有效的防范措施。指導工作人員對潔凈手術室進行維護、管理和清掃。
潔凈手術室凈化空調系統的運行程序:通常是術前0.5～1h開啟凈化空調系統，并開至低速運行狀態，術前15～30min將系統調至正常運行狀態，術畢再調回低速運行狀態，進行室內衛生清潔工作。若凈化空調系統支持，在進行室內衛生清潔工作時，應直流通風換氣，以便迅速排除室內污染。若潔凈手術室長時間未使用，在使用前除做好風口、壁板、地面等處的清潔、消毒工作外，還應適當提前開啟凈化空調系統。應急潔凈手術室及其輔助設施，凈化空調系統應24h連續低速運行，以滿足急診手術的使用和空氣潔凈度的要求。若采用臭氧對潔凈手術室及凈化空調系統進行消毒，應關閉新風閥及排風閥，以保證消毒效果。臭氧消毒過程中，潔凈手術室內不得有人員停留，以防損害人的呼吸系統（因為臭氧具有強氧化性，當人體吸入后，能夠迅速地轉化為活性很強的自由基，引起上呼吸道的炎癥病變）。同時，應做好有關精密儀器、儀表的保護工作，以防臭氧對其電路板產生腐蝕。